年，正德十六年，明武宗暴亡，结束了他荒唐的一生。他在临死前对于明朝的对外关系留下遗命：“进贡夷人，俱给赏，令还国。”武宗无嗣，他的堂弟兴献王朱佑杬的长子朱厚熜即皇帝位，即明世宗嘉靖皇帝。
这位岁即位的少年天子大整朝纲，诛佞臣，除弊政，清明一时。值此之时，又一支葡萄牙船队来到广东沿海要求与天朝贸易，气焰嚣张。礼部和兵部奏称：葡萄牙人假借通使，实则是贩货通市，并且强占广东外海岛屿，图谋不轨。嘉靖帝下令囚禁此前来华的葡萄牙使臣皮列士，并发兵驱逐在广东骄纵的葡萄牙舰队。
广东海道副使汪鋐受命指挥天朝水师驱逐广东屯门岛上的葡萄牙人。葡萄牙首领阿尔瓦雷斯率领舰船艘盘踞于此，并在屯门岛上修筑了工事。汪鋐率水师进攻葡萄牙大船，但在葡萄牙炮火之下损失严重，第一次进攻未能成功。
汪鋐随后制定火攻计划，在船上装满膏油草料，用火船直扑向葡萄牙大船，同时派遣一支潜水部队从水下凿穿葡萄牙船。待葡萄牙人慌乱之际，汪鋐亲率4余名兵士登上敌船与葡萄牙人对战。最终，葡萄牙人败退，趁天黑驾驶剩余三艘船退出屯门岛海域，逃回马六甲。
屯门海战是新旧两大帝国之间的第一次正面交锋，也是天朝与西方列强爆发的首次战争，以天朝人的胜利而告终。次年月，另一位葡萄牙使臣马丁·阿方索率领余人分乘五艘军舰抵达广东。他来的目的是与天朝谈判，并奉命在天朝沿海建立据点。然而，此时防守广东的明军已经得令，凡见到悬挂葡萄牙旗帜的船只一律击毁。
葡萄牙舰队航行至新会西草湾时与前来阻击的明军水师遭遇，爆发了著名的“西草湾之战”。葡萄牙舰队面对汹涌的明朝军队，很快败退。史料记载，明军“生擒别都卢、疏世利等四十二人，斩首三十五级，获其二舟”。明军将领还缴获葡军火炮，“官军得其炮，即名为佛郎机”，这些火炮后来被明军用于西北战场。另有数十名被明军俘虏的葡萄牙官兵被枭首示众。
经过屯门和西草湾两次交锋，葡萄牙人见识到了这个东方大帝国与他们在非洲、印度和东南亚的对手都不同。论当时的国力，明帝国几乎可以与整个西方抗衡；论军力，仅在这个帝国边陲的广东省就驻有多达万军队，比整个葡萄牙全国的军队还要多。明帝国军队总数约万，超过葡萄牙人口总和。两次交战使葡萄牙人认识到用直接的武力扩张对付天朝是行不通的。
无法在天朝建立商业据点的葡萄牙人加入了天朝东南沿海的走私贸易和海盗的行列。嘉靖十九年（4）前后，葡萄牙人与倭寇及天朝海盗李光头、许栋等人勾结，在宁波的双屿建立据点，时常骚扰沿海的中国商人和百姓。嘉靖二十七年（4年），副都御史朱纨调遣都指挥卢镗、副使魏一恭等率兵进攻双屿，终于将他们一网打尽，烧毁营房、杀死俘虏了葡萄牙人大部。部分逃脱的葡萄牙人又转移到福建泉州的浯屿（今金门），联合海盗为祸漳、泉一带。
嘉靖二十年（4年），朱纨和福建巡海道副使柯乔合力进攻浯屿，并在走马溪一带截住葡萄牙船队，予以重创，海盗头目李光头等九十六人被打死。由于葡萄牙人的为非作歹，明廷严令天朝沿海居民不得与葡萄牙人贸易，禁止向他们提供给养。
在天朝建立殖民据点努力的失败及在走私贸易中受到的打击使葡萄牙人彻底认清了明帝国的实力，为了继续开展对华贸易，他们彻底转变了态度。葡萄牙国王若奥三世给远东的葡萄牙人下达了新的对华指令，即“努力寻求和平与友好”，这埋下了“马可问题”的伏笔。
在葡萄牙转变对华政策的同时，明朝政府正经历深刻的内外危机。年，北方朦国铁骑突破长城，一路烧杀抢掠，发生了著名的“庚戌之变”，年，朦国军队余万再次南下寇关。同时，南方江浙、广东一带倭寇和天朝海盗极其猖獗。在这种内忧外患的背景之下，明政府也转变了对葡萄牙人的态度。正如学者费成康所说：“在北起长城南至广东烽火遍地、危机四伏的险境中，有一股敌对势力主动愿意和解，广东官府直至明政府自然是极为欢迎的。”
葡萄牙人协助明政府抓捕海盗是两国交好的重要表现。福建同安人林希元在《与翁见愚别驾书》中记载：“林剪（海盗）横行海上，官府不能治，彼则为我除之，二十年海盗，一日而尽，据此则佛郎机未尝为盗，且为我御盗；未尝害吾民，且有利于吾民也。”此事应发生在嘉靖二十六年(4年)前后，中葡联合剿灭了浙江双屿附近的海盗。
两大帝国的握手言和是马可问题出现的背景。嘉靖三十二年，即年，一位葡萄牙的商人头目莱奥内尔·索萨以谦恭的态度寻求与天朝贸易。经过友好谈判，广东海道副使汪柏代表明政府同意了葡萄牙人的贸易请求。
同时，葡萄牙人声称商船遇到风暴，要借马可曝晒货物，汪柏在收受葡萄牙人的贿赂之后准允他们上岸定居。《明史·佛朗机传》上说：“自（朱）纨死，海禁复弛，佛郎机遂纵横海上无所忌。而其市香山澳、壕镜者，至筑室建城，雄踞海畔，若一国然，将吏不肖者反视为外府矣。”葡萄牙人对澳门的经营，使之成为远东贸易的重要中转站和据点。
马可位居古代西太平洋海上贸易网的中心位置，在葡萄牙人的经营下，日渐成为远东贸易航路的中心。马可至日本长崎、马可至马尼拉、马可至香料群岛的航线成为葡萄海上商业帝国的重要组成部分。
当然，由于紧贴远东地区最大的市场和原料产地——天朝，从马可出发的商船装载最多的还是天朝商品。马可－马六甲－果阿－里斯本航线成为是葡萄牙的经济命脉，这条航路全长达多公里，绕地球半圈。
万历年间，明朝政府派官吏管理马可，每年向葡萄牙人征收地租税金。在清朝末叶以前，葡萄牙人与清政府基本维持了和平友好的关系，从主权上说，虽然他们定居马可，但从未享有主权，其与天朝政府是一种租赁关系。在此期间，马可的葡萄牙人还曾数次协助天朝政府镇压兵变和剿灭海盗。如嘉靖四十三年（4年），粤东柘林兵变，广州被围，总兵俞大猷曾派人联系马可的葡萄人夹击叛军，“功成重赏其夷目”。万历年间，两广总督刘尧诲还曾联合居澳葡人夹击海盗林道乾，“赏赐银牌，花彩缎如礼，与我师并击”。
不过，这一友好关系伴随着清末中华帝国的衰颓而一度发生变化，直到年才彻底解决。总之，马可问题长期作为中葡两国关系的缩影，成为世纪中葡两大帝国碰撞与交往的历史见证。
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